近日，来自荷兰的一个研究团队，在国际顶级学术期刊《自然》上发表了22种转移性实体瘤的全基因组测序研究成果[1]。
这项由hartwig医学基金会edwincuppen教授领导的研究，对2399位癌症患者的2520对肿瘤和血液样本进行了全基因组测序和特征分析。
共鉴定出7000多万个体细胞变异，包括近6000万个单核苷酸变异（snv），84万个多核苷酸变异（mnv），960万个dna片段插入和缺失（indels），以及65万多个结构变体（sv），并且获得了每个转移肿瘤样本的遗传突变名录。
基于上述数据，研究人员发现，可能真的没有驱动癌症转移的特异性突变存在。而且，转移的肿瘤组织中，普遍存在全基因组加倍（wgd）事件，在一些癌种中甚至高达80%，而在原发灶中只有30%。这可能与转移灶对化疗的耐受性相关。
除此之外，研究人员还发现，在单一的转移灶中，肿瘤细胞的异质性非常低，高达96%的基因突变是克隆性的。还有高达80%的抑癌基因通过不同的方式双等位失活。
更为重要的是，研究人员还发现，通过全基因组测序，能帮助62%的患者找到已经获批或者正在开展研究的抗癌药物。
据了解，这也是该领域迄今为止最大的研究。
▲ 探索转移肿瘤的秘密（https://www.nature.com/articles/d41586-019-03123-0）
近年来，测序技术的进步和测序成本的降低，推动了全基因组测序技术在癌症研究中的应用。成年人[2，3]和儿童[4，5]肿瘤的大规模研究，让科学家从分子水平上，对这些癌症有了深入的认知。
这也就顺理成章地推动了基于基因变异开展的癌症治疗[6]。在我们精心打磨的音频课程《医学趋势50讲》中，我们全面地介绍了基因测序在癌症诊疗中的应用，欢迎大家扫描文末二维码试听订阅。
不过，以上的研究大多是在原发肿瘤中开展的，而对于造成90%的癌症死亡的转移，类似的研究却极少。即使有少量转移癌症的研究，要么仅限于特定的癌种[7-9]，要么只研究了一些特定的基因[10]，要么是外显子层面的研究[11]。
此外，由于随着癌症的进展，原发灶和转移灶都在不停地进化[12，13]，也只有全基因组研究能一窥癌症转移的秘密了。因此，对癌症的转移展开全基因组、泛癌种的研究非常有必要。
在荷兰hartwig医学基金会和个性化癌症治疗中心（cpct）的统一协调下，荷兰的49家医院参与了这项大规模的研究。截止目前为止，数据库已经累计获取了超4000名患者的数据，还在持续增长中。
▲ 论文非常火爆
接下来，我们就一起来看看研究人员从参与本研究的2399位癌症患者的肿瘤组织中获得了哪些数据。
首先是每种癌症的不同类型变异的负担情况。
单核苷酸变异（snv）的情况：黑色素瘤的中位snv是44000个，肺癌的是36000，肉瘤的是4100，神经内分泌肿瘤的是3500。这些突变特征，与之前的研究相比，基本匹配[14]。
多核苷酸变异（mnv）的情况：肺癌的中位mnv是821，皮肤癌的是764，这两种癌症的mnv是其他癌种的5倍。这可能与紫外线照射（cc＞tt）和吸烟（cc＞aa）突变特征比较丰富有关。
插入和缺失（indels）的中值只有snv的十分之一左右，皮肤癌和肺癌发生率相对较低。
微卫星不稳定（msi）的发生率：中枢神经肿瘤9.4%，子宫肿瘤9.1%，前列腺肿瘤6.1%。结直肠癌转移灶的msi仅为4%，低于之前报道的原发性结直肠癌出现频率[15]。
所有肿瘤的中位结构变异（sv）数为193。相对较高的是卵巢肿瘤的412，食管癌的372；较低的是肾癌的71，神经内分泌肿瘤的56。在所有的结构变异中，简单缺失是最常见的，占所有结构变异的33%。除开胃癌和食管癌，缺失性结构性变异在其他肿瘤中比较普遍。
▲ 转移癌症的突变图谱（其实是“天书”）
以上这些结果是转移癌组织与血细胞基因组对比的结果。反映的是转移组织自身的变化，但是没有反映出转移肿瘤组织与原发肿瘤组织之间的差异。
为了了解原发灶和转移灶之间的总体基因组差异，研究人员将他们的这个数据，与迄今最大的原位肿瘤测序数据库pcawg[16]做了个比较。你没看错，本研究没有分析患者的原发肿瘤基因组数据，对比的数据是其他数据库的数据。
pcawg这个全基因组测序肿瘤队列，包括2583个肿瘤样本，其中95%的样本是未经治疗的原发肿瘤。
将本研究的数据与pcawg的数据相比，研究人员发现：单核苷酸变异没有显著差异，意味着单核苷酸变异突变负荷似乎与疾病进展无关，但前列腺癌、乳腺癌和中枢神经肿瘤是例外。
相比之下，转移灶的插入和缺失、多核苷酸变异和结构变异的突变负荷更高，尤其是前列腺癌，研究人员观察到多核苷酸变异，插入和缺失和结构变异的发生率增加了四倍以上。
▲ 患者选择过程
再回过头分析转移肿瘤组织基因拷贝数的变化，研究人员又发现，包含egfr、ccne1、ccnd1和mdm2这些癌基因的区域，经常发生扩增。另外一个现象是常染色体dna存在杂合性丢失（loh），以tp53的loh出现频率最高，出现在67%的肿瘤样品中，其他的很多抑癌基因也出现loh。
但没有发现大片段常染色体的纯合缺失，即使是基因纯合缺失也非常罕见。然而，有一个特殊的情况是，y染色体缺失，36%的男性肿瘤样本存在y染色体缺失，不过肿瘤之间差异非常大，从中枢神经肿瘤的5%到胆管肿瘤的68%。
还有一个比较常见现象的是全基因组加倍（wgd），56%的肿瘤样本出现了这种现象，从中枢神经肿瘤的15%到食管癌的80%。而且这种情况，远远高于之前报道的原发肿瘤的25%-37%[17-19]。
全基因组加倍在一定程度上增强了癌细胞对化疗的耐药性。而且这种加倍还可以为癌细胞起到缓冲保护作用，防止基因组不稳定、破坏性突变或者染色体片段丢失，给癌细胞带来的致命打击[20]。
▲ 拷贝数变异图谱
随后，研究人员又给一些关键的癌症驱动突变列了个名录，发现与之前的研究基本相似。其中tp53（52％的样本），cdkn2a（21％），pik3ca（16％），apc（15％），kras（15％），pten（13％）和tert（12％）被确定为最常见的突变基因，它们共同构成目录中所有候选驱动突变的26％。
不过，他们这个名录中排前十的基因突变，在这个队列中的检出率高于原发癌[21]。
遗憾的是，与之前的研究数据库相比较，研究人员只找到了两个有可能驱动癌症转移的基因变异，它俩分别是存在于结直肠癌转移灶样本中的mlk4（又名map3k21），和存在于乳腺癌转移灶样本中zfpm1。这个研究结果再次证实了，“可能不存在转移驱动基因变异”这一猜想。
单从单个患者的角度来看的话，平均每位患者的总驱动突变数量为5.7，其中尿路肿瘤的最高（平均值为8.0），而神经内分泌肿瘤最低（平均值为2.8）。
▲ 常见驱动基因突变
单从抑癌基因的角度看的话，研究人员认为它们的研究结果支持knudson在1971年提出的双重打击假说[22]。因为80%的抑癌基因驱动突变是双等位失活，也就是说它们彻底完蛋了。这个比例也是迄今为止在癌症全基因组研究中最高的。
对于很多重要的抑癌基因而言，它们的双等位失活率接近100%，例如，tp53（93％），cdkn2a（97％），rb1（94％），pten（92％）和smad4（96％）。这表明，抑癌基因的双等位失活可能对于癌症的转移非常重要。
研究人员还分析了驱动基因突变成对共存的情况，发现了10对相互排斥的基因组合，以及10对同时存在的基因组合。不过上述的相关性，大部分在之前的研究中已经被建立，只有乳腺癌中有新发现。gata3和vmp1，以及foxa1和pik3ca，总是成对出现；而esr1和tp53，以及gata3和tp53，总是有你没我，有我没你。
如果上述关系能在后续的研究中进一步确立，那么就会多出4个治疗乳腺癌的新靶点，而且后面两对似乎是目前大热的协同致死基因对。
▲ 不同癌种驱动变异类型分布
在研究肿瘤的进化动力学过程中，研究人员发现，在整个队列中，只有6.6%的单核苷酸变异（snv）、多核苷酸变异（mnv）和插入缺失突变，以及3.7%的癌症驱动点突变属于亚克隆。这个比例着实有点儿低。
而且，即使是样本纯度超过80%的样品，亚克隆变异的占比也仅有10.6%。这个比例还是远远低于之前在原发癌中观察到的数据[13]。这就意味着，癌症转移灶非常单一，异质性很低，至少在这个研究中是这样的。
关于这个问题，研究人员也有些其他的思考，可能部分归因于标本的采集方式：因为几乎所有的样本都是通过穿刺活检获得的。如果是因为这个原因的话，液体活检就显得尤为重要了。
基于上述结果，研究人员提出了一个转移模型，他们认为，单个转移灶在任何一个时间点都是由单克隆主导的，有限的肿瘤进化和亚克隆筛选发生在远距离转移之后。当然，他们这个模型不能否认，转移灶中可能存在大量低频的亚克隆。
他们的这个结果与存在多个主要亚克隆的原发肿瘤相反[13，23]，不过也与之前的一些认为转移灶中驱动基因异质性低的结果暗合[7，24]。
▲ 临床应用价值
那么发现的这些突变对患者的治疗有没有价值呢？
研究人员发现，在1480名患者（占所有患者的62%）的转移灶肿瘤样本中，至少有一个与用药有关的变异。
其中约一半患者的基因变异，有已经获批或者正在开展临床研究的药物可用，而且没有出现与耐药相关的基因变异。除了上面的50%有药物可用的患者之外，还有31%的患者需要的药物正处于实验室研发阶段。
总的来说，这个大型的队列研究，揭示了一些癌症转移的小秘密，也证明了全基因组测序对癌症精准医疗的重要性。
据悉，这个研究队列的数据是开放的，除了患者的敏感信息之外，所有的数据都可以在数据库的凯发官网入口官网调用（https://www.hartwigmedicalfoundation.nl/en/）。
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（来源于： 奇点糕奇点网）